这种共聚焦技术利用激光作为激发光源，将激光聚焦于样品中的某一点，这样只有该点附近的区域有荧光，其他没有被激发的部位没有荧光，这一区域发出的荧光反射到光电倍增管，在光电倍增管前设有1 个计算机控制的可调节针孔， 保证只有被激发点发出的荧光才能到达光电管，而附近其他点所发出的荧光被挡在视野之外。采用计算机控制激光和针孔， 对细胞内的某一层面进行扫描，可以获得清晰的二维图像。

    这一技术成像速度快、自动化程度高。但激光具有单色性，一种激光器只能发出某几个特定波长的激光，而荧光染料的种类很多，其激发光波长各不相同，这样在使用某种型号的激光器时，只有少数几种荧光染料可以使用， 而其他大多数的染料不能使用；目前同时配备数个不同激光器或多光子脉冲激光器的激光共聚焦系统的出现，虽然可以解决这一难题，但是设备结构复杂、价格昂贵，维护保养要求较高。

    这一技术是随着计算机软件技术的发展出现的，与激光共聚焦的原理有极大的区别， 它在普通的荧光显微镜上加上1 个计算机控制的高分辨率、带有制冷装置(以提高信噪比) 的CCD 摄像机， 摄像机获取的图像由计算机进行解卷积(deconvolution) 计算， 这种数字式图像处理可以将聚焦平面以外的图形信号删除， 保留高清晰度的焦平面信息。

    这一系统硬件配备比较简单，价格远远低于激光共聚焦系统；由于使用可以发出连续光谱的高压汞灯或氙灯作为光源，使这一技术几乎可以用于所有的荧光染料，应用范围广泛， 其机械部分组成简单，灵活性高。这一技术的不足在于其图像获取、计算对计算机的依赖性高，图象获取时间相对较长，实验时除要分析的层面被激发外，细胞内其他部位也被激发， 增加了荧光染料的光淬灭，对某些容易被光淬灭的染料会造成明显的影响；随着计算机和摄像技术的发展，这些问题也在逐步解决。